Sperone Speroni nacque nell'antica famiglia padovana Speroni degli Alvarotti nell'antico palazzo di famiglia in contrà Sant'Anna. Il padre Bernardino fu archiatra di papa Leone X, la madre Lucia era esponente dei Contarini. Bambino prodigio negli studi, divenne professore di logica dell'Università di Padova a soli diciotto anni.

Dopo pochi anni di insegnamento però decise di approfondire gli studi a Bologna, dal famoso filosofo aristotelico Pietro Pomponazzi. Alla morte di costui, nel 1525, tornò a Padova dove insegnò per altri tre anni, fino al decesso del padre; dopo di ciò dovette occuparsi attivamente della sua famiglia.

A questo periodo risale la composizione dei dialoghi che verranno pubblicati dall'amico Daniele Barbaro nel 1542, con il titolo di Dialogi: sono il Dialogo d'amore, quello Della dignità delle donne, quello Del tempo di partorire delle donne e quello Della cura famigliare, i due dialoghi lucianei Della usura e Della discordia, seguiti da quello Delle lingue e da quello Della retorica, e infine quello Delle laudi del Catajo, villa della S. Beatrice Pia degli Obici e quello Intitolato Panico e Bichi. Questi dialoghi sono le opere più note di Speroni, nonostante siano stati pubblicati a sua insaputa e non siano mai stati riconosciuti, e hanno avuto decine di ristampe nel corso del Cinquecento.

A questo periodo risale anche la composizione del Dialogo della vita attiva e contemplativa, che non venne però inserito nei Dialogi del '42, per motivi tuttora sconosciuti.

Membro dell'Accademia degli Infiammati e amico di Torquato Tasso si occupò della revisione della Gerusalemme liberata. Fu autore della Canace, pubblicata a Venezia nel 1546, tragedia che darà seguito a un'accesa polemica tra l'autore e Giambattista Giraldi Cinzio.